การศึกษาลักษณะของไทโรซิเนสจากเห็ดฟางในสภาวะที่ถูกตรึงด้วยวิธีเชื่อมไขว้

Abstract

          เห็ดเป็นแหล่งผลิตไทโรซิเนสที่มีราคาถูกซึ่งเอนไซม์ดังกล่าวสามารถนำมาใช้เป็นตัวเร่งปฏิกิริยาสำหรับการสังเคราะห์ L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) ได้ เมื่อนำไทโรซิเนสจากเห็ดฟางมา ทำให้เข้มข้นโดยตกตะกอนด้วยเกลือแอมโมเนียมซัลเฟต และนำไปตรึงโดยใช้ glutaraldehyde เป็นตัวเชื่อมไขว้ที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส เป็นเวลา 16 ชั่วโมง พบว่าความเข้มข้นของตัวเชื่อมไขว้ที่เหมาะสมเท่ากับ ร้อยละ 1.5 โดยปริมาตร ไทโรซิเนสตรึงรูปที่เตรียมได้มีสภาวะที่เหมาะสมสำหรับการเร่งปฏิกิริยาที่พีเอช 7.0 อุณหภูมิ 40 องศาเซลเซียส ในขณะที่ไทโรซิเนสในสภาวะที่ไม่ถูกตรึงมีพีเอชและอุณหภูมิที่เหมาะสมเท่ากับ 6.0 และ 30 องศาเซลเซียส ตามลำดับ ค่าคงที่จลนพลศาสตร์ของไทโรซิเนสตรึงรูปเมื่อใช้ไทโรซีนเป็นสารตั้งต้นมีค่าสัมพรรคภาพและอัตราเร็วสูงสุดเท่ากับ 0.261±0.057 มิลลิโมลาร์ และ 0.053±0.0081 มิลลิโมลาร์ต่อนาที ตามลำดับ เมื่อทดสอบการนำไทโรซิเนสตรึงรูปกลับมาใช้ซ้ำพบว่าไทโรซิเนสตรึงรูปยังคงมีกิจกรรมเอนไซม์เหลืออยู่ครึ่งหนึ่ง หลังผ่านการใช้งานไป 3 รอบ โดยเวลาที่ใช้ในแต่ละรอบเท่ากับ 4 ชั่วโมง ผลการสังเคราะห์ L-DOPA โดยใช้ไทโรซิเนสตรึงรูปที่มีค่ากิจกรรมจำเพาะเท่ากับ 12.3 หน่วยต่อกรัม ในสภาวะที่เหมาะสมพบว่าสามารถผลิต L-DOPA ได้ 0.0025 มิลลิโมลาร์ ในเวลา 2 ชั่วโมง           Mushroom is considered as a cheap source of tyrosinase for L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) production. Tyrosinase extracted from fresh straw mushroom (Volvariella volvacea) was concentrated by ammonium sulfate precipitation and immobilized as cross-linked enzyme aggregates (CLEAs) with the optimal glutaraldehyde concentration of 1.5% (v/v) at 4 °C for 16 h. The optimum pH and temperature on CLEAs-tyrosinase activity was found at 7.0 and 40 °C, respectively while the free tyrosinase exhibited pH and temperature optima at 6.0 and 30 °C, respectively. The apparent Km and Vmax values of CLEAs-tyrosinase for L-tyrosine were 0.261±0.057 mM and 0.053±0.0081 mM min-1, respectively. The CLEAs tyrosinase retained 50% activity after three reuses with 4 h of each reaction cycle. The CLEAs tyrosinase with the specific activity of 12.3 units/g could produce 0.0025 mM L-DOPA in 2 h under the optimized conditions.