การพัฒนาและทดสอบความใช้ได้ของวิธี Folin-Ciocalteu แบบเซมิไมโครสำหรับวิเคราะห์ปริมาณสารประกอบฟีนอลิกรวมในสารสกัดใบรางแดง (Ventilago denticulata Willd.)

Development and Validation of the Folin-Ciocalteu Semi-Micro Method for Total Phenolic Compounds Determination in Rangdaeng (Ventilago denticulata Willd.) Extract

Abstract

การวิจัยนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อพัฒนาวิธี Folin-Ciocalteu แบบเซมิไมโครและทดสอบความใช้ได้ของวิธีการสำหรับวิเคราะห์ปริมาณสารประกอบฟีนอลิกรวมในสารสกัดใบรางแดง (Ventilago denticulata Willd.) ผลการศึกษาพบว่า สภาวะที่เหมาะสมของวิธี คือ ใช้สารตัวอย่าง 100 ไมโครลิตร สารละลาย Folin-Ciocalteu phenol reagent เข้มข้นร้อยละ 20 โดยปริมาตร 250 ไมโครลิตร สารละลายโซเดียมคาร์บอเนตเข้มข้นร้อยละ 3.75 โดยมวลต่อปริมาตร 100 ไมโครลิตร เวลาเข้าสู่สมดุล 40 นาที และใช้กรดแกลลิกเป็นสารมาตรฐาน ให้ค่าการดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่น 765 นาโนเมตร ไม่แตกต่างจากวิธี Folin-Ciocalteu แบบมีโซซึ่งเป็นวิธีที่ใช้ปริมาณสารมากกว่าวิธีนี้ 20 เท่า (P>0.05) การทดสอบความใช้ได้ของวิธี พบว่ามีความเป็นเส้นตรง (R2>0.999) และมีความจำเพาะ (กราฟมาตรฐานและกราฟแสดงความจำเพาะขนานกันมีความชันแตกต่างกันร้อยละ 0-5.91) ขีดจำกัดของการตรวจวัด (LOD) และขีดจำกัดของการวัดปริมาณ (LOQ) เท่ากับ 3.70 และ 11.22 ไมโครกรัมต่อมิลลิลิตร ตามลำดับ ความแม่นและความเที่ยงอยู่ในช่วงที่ยอมรับได้ มีร้อยละของการกลับคืน เท่ากับ 82.11-105.31 และ %RSD=4.77-6.42 ความเที่ยงของการทวนซ้ำในวันเดียวกัน, การทำซ้ำต่างวันกัน และ intermediate-precision method มีค่า %RSD=0.77-2.42, 2.41-3.63 และ 1.39-3.26 ตามลำดับ มีความคงทนต่อการเปลี่ยนแปลงอุณหภูมิในช่วง 20-50 องศาเซลเซียส (%RSD=0.21-6.03) เมื่อนำวิธีที่พัฒนาได้ไปวิเคราะห์ปริมาณฟีนอลิกรวมในสารสกัดใบรางแดงเทียบกับวิธี Folin-Ciocalteu แบบมีโซ พบว่า มีค่า 73.87±0.75 และ 74.61±0.82 มิลลิกรัมกรดแกลลิกต่อกรัมน้ำหนักแห้ง ตามลำดับ ซึ่งไม่แตกต่างกันทางสถิติ (P>0.05) สรุปได้ว่า วิธี Folin-Ciocalteu แบบเซมิไมโครที่พัฒนาได้ในการศึกษานี้สามารถใช้วิเคราะห์ปริมาณสารประกอบฟีนอลิกรวมในตัวอย่างที่ต้องวิเคราะห์เป็นประจำได้ดีเนื่องจากใช้เวลาทำปฏิกิริยาและใช้สารละลายน้อยลง ลดการใช้สารเคมี เกิดของเสียน้อยลง จึงปลอดภัยและเป็นมิตรต่อสิ่งแวดล้อมมากขึ้น              The purposes of this research were to develop and validate the Folin-Ciocalteu semi-micro method for total phenolic compounds determination in Rangdaeng (Ventilago denticulata Willd.) extract. The results showed that the optimum condition was as follows: 100 µL of sample, 250 µL of 20%v/v Folin-Ciocalteu phenol reagent, 100 µL of 3.75%w/v Na2CO3 and 40 minutes of the equilibrium time using gallic acid as the standard. The absorbance at 765 nm was no significant difference (P>0.05) compared with the conventional Folin-Ciocalteu meso-method (20 folds in volume of the sample and reagents). Method validation revealed good linearity (R2>0.999) and specificity (calibration curve and specificity curve were paralleled with 0-5.91% of slope difference). LOD and LOQ was 3.70 and 11.22 µg/mL, respectively. Accuracy and precision of the method were acceptable. Percentage of recovery and %RSD were in the range of 82.11-105.31 and 4.77-6.42, respectively. Repeatability (intra-day), reproducibility (inter-day) and intermediate-precision method as %RSD were 0.77-2.42, 2.41-3.63 and 1.39-3.26, respectively. Method also showed the robustness under temperature in the range of 20-50 ºC (%RSD=0.21-6.03). The developed Folin-Ciocalteu semi-micro method was applied to the determination of total phenolic compounds (TPC) in Rangdaeng (V. denticulata) extract, compared with the Folin-Ciocalteu meso-method. The results showed that the TPC were 73.87±0.75 and 74.61±0.82 mg GAE/g dw, respectively, which were not different significantly (P>0.05). In conclusion, the Folin-Ciocalteu semi-micro method is appropriated to the routine assay. Due to the decreasing in the reaction time, it is faster. This method reduces solution volume, chemical usage and wasted discharge so it is more environmental-friendly and safer.