การตรวจสอบ Hb Constant Spring, Hb Pakse และ Hb Quong Sze ด้วยวิธี Real-Time PCR และ High Resolution Melting Analysis
Detection of Hb Constant Spring, Hb Pakse and Hb Quong Sze by Real-Time PCR and High Resolution Melting Analysis
Keywords:
แอลฟาธาลัสซีเมีย , ฮีโมโกลบินเอช , การวิเคราะห์เอชอาร์เอ็ม , ฮีโมโกลบิน, alpha thalassemia , hemoglobin H, high resolution melting analysis , hemoglobinAbstract
แอลฟาธาลัสซีเมียเป็นโรคโลหิตจางทางพันธุกรรมที่พบได้ส่วนใหญ่ในประเทศไทยมีอุบัติการณ์ร้อยละ 30-40 โดย compound heterozygous alpha-thalassemia 1 และ non-deletional alpha-thalassemia ทำให้เกิดโรค Hb H ที่มีอาการรุนแรง ดังนั้นวิธีการที่ใช้สำหรับการตรวจสอบ non-deletional alpha-thalassemia ที่รวดเร็วและมีความแม่นยำจึงมีความสำคัญต่อการรักษาและป้องกันธาลัสซีเมีย วัตถุประสงค์ของการศึกษาเพื่อพัฒนาวิธี high resolution melting (HRM) analysis สำหรับตรวจสอบ non-deletional alpha-thalassemia ชนิด Hb CS, Hb PS และ Hb QS โดยมีการใช้ไพรเมอร์ 2 ตำแหน่งที่คร่อมบริเวณการกลายพันธุ์ของ non-deletional alpha-thalassemia และหาอุณหภูมิที่เหมาะสมของไพรเมอร์ด้วยการทำ gradient PCR จากนั้นทดสอบการทำ real-time PCR และ HRM analysis ในตัวอย่างดีเอ็นเอที่ได้รับการตรวจสอบแล้วด้วยวิธี sequencing หลังจากนั้นทำการตรวจสอบในตัวอย่างดีเอ็นเอ 40 ตัวอย่าง จากหน่วยธาลัสซีเมีย มหาวิทยาลัยพะเยา วิธี real-time PCR และ HRM analysis ที่ได้พัฒนาขึ้นสามารถจำแนก heterozygous Hb CS, Hb H CS, homozygous Hb CS, heterozygous Hb PS และ homozygous Hb QS ออกจากดีเอ็นเอปกติได้ ผลการตรวจสอบ ในตัวอย่าง 40 ตัวอย่างให้ผลเป็นลบจำนวน 30 ตัวอย่าง heterozygous Hb CS จำนวน 3 ตัวอย่าง ในขณะที่ 7 ตัวอย่าง ไม่สามารถตรวจพบ PCR product ซึ่งพบเป็น alpha-thalassemia 2 ชนิด 3.7 deletion สรุปได้ว่าวิธี HRM analysis เป็นวิธีที่มีความถูกต้องและความไวสำหรับการคัดกรองอย่างรวดเร็วและการจำแนก Hb CS, Hb PS และ Hb QS ได้ Alpha thalassemia is one of the most common inherited anemia disorders in Thailand with prevalence at 30 to 40%. Compound heterozygous alpha-thalassemia 1 and non-deletional alpha-thalassemia gives rise to severe Hb H ( --/ -αT ) disease. Thus, the rapid and accurate method for detection of non-deletional alphathalassemia is important for thalassemia treatment and prevention. The aim of this study was to develop HRM method for detection of non-deletional alpha-thalassemia including Hb CS, Hb PS and Hb QS. Two HRM primers, which specified for alpha-thalassemia 2, were used to identify three non-deletional alpha-thalassemia, and the optimized temperature was performed by gradient PCR. Next, real-time PCR and HRM analysis were established with positive control DNA carried Hb CS, HB PS, Hb QS and normal that were determined by DNA sequencing technique. After that, we examined 40 DNA samples from Thalassemia Unit, University of Phayao. The real-time PCR and HRM analysis could be able to identify control DNA including heterozygous Hb CS, Hb H CS, homozygous Hb CS, heterozygous Hb PS and homozygous Hb QS from negative DNA. 30 of 40 samples were negative, 3 samples were heterozygous Hb CS while, PCR product was not detected in 7 samples, that were the alpha-thalassemia 2 with 3.7 deletion. In conclusion, the real-time PCR and HRM method appears to be an accurate and sensitive method for the rapid screening and identification of Hb CS, Hb PS and Hb QS.References
Du, L., Bao, X., He, W., Qin, D., Wang, J., Xiong, Y., Shi, X., Ding, H., Yao, C., & Wu, J. (2021). Severe fetal anemia and hydrops fetalis associated with compound heterozygosity for Hb Zurich-Albisrieden (HBA2: c.178G>C) and Hb Quong Sze (HBA2:c.377T>C).The Journal of international medical research,49(7), 3000605211031429.
He, S., Zheng, C., Meng, D., Chen, R., Zhang, Q., Tian, X., & Chen, S. (2015). Hb H Hydrops Fetalis Syndrome Caused by Association of the - -(SEA) Deletion and Hb Constant Spring (HBA2: c.427T > C) Mutation in a Chinese Family. Hemoglobin,39(3), 216–219.
Kalle Kwaifa, I., Lai, M. I., & Md Noor, S. (2020). Non-deletional alpha thalassaemia: a review. Orphanet journal of rare diseases,15(1), 166.
Lemmens-Zygulska, M., Eigel, A., Helbig, B., Sanguansermsri, T., Horst, J., & Flatz, G. (1996). Prevalence of alpha-thalassemias in northern Thailand. Human genetics,98(3), 345–347.
Na-Nakorn, S., & Wasi, P. (1970). Alpha-thalassemia in Northern Thailand. American journal of human genetics,22(6), 645–651.
Nittayaboon, K., & Nopparatana, C. (2018). Molecular characterization of Hb H disease in southern Thailand. International Journal of Hematology, 108, 384-389.
Sanguansermsri, T. (2014). Condition of thalassemia trait. Journal of Hematology and Transfusion Medicine, 24(4), 329-332. (in Thai)
Seeratanachot,T., Shimbhu, D., Charoenkwan, P., & Sanguansermsri,T. (2015). Detection of deletion α + - thalassemia mutation [-α (3.7), -α (4.2)] by quantitative PCR assay. The Southeast Asian journal of tropical medicine and public health, 46(1), 110-115.
Suwannakhon, N., Seeratanachot, T., Mahingsa, K., Namwong, P., & Sanguansermsri,T. (2014). Prevalence of alpha thalassemia trait in the volunteered personals of Phayao University. Journal of Hematology and Transfusion Medicine,24(2), 129-136.
Wee, Y. C., Tan, K. L., Chua, K. H., George, E., & Tan, J. A. (2009). Molecular characterisation of Haemoglobin Constant Spring and Haemoglobin Quong Sze with a Combine-Amplification Refractory Mutation System.The Malaysian journal of medical sciences: MJMS,16(3), 21–28.
