การศึกษาสมบัติของแอลฟา–อะไมเลสทนความร้อนจากเมล็ดถั่วขอกำลังงอก

Characterization of Thermostable α–Amylase from Germinating Cowitch (Mucuna pruriens (L.) DC.) Seeds

Abstract

การแยกบริสุทธิ์แอลฟาอะไมเลสจากเมล็ดถั่วขอกำลังงอก (Mucuna pruriens (L.) DC.) (MpAmy) ด้วย 2 ขั้นตอน คือ การตกตะกอนด้วยเกลือแอมโมเนียมซัลเฟต 35–65% (w/v) และ β–cyclodextrinsepharose 6B affinity chromatography พบว่าเอนไซม์ มีความบริสุทธิ์ขึ้น 216.4 เท่า และมีกิจกรรมจำเพาะ 91.0 U/mg การวิเคราะห์ด้วยเทคนิค Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS – PAGE) พบว่าเอนไซม์มีขนาดโมเลกุล 58 kDa ซึ่งมีขนาดโมเลกุลที่สอดคล้องกับกิจกรรมการทำงาน โดย Zymographic method การศึกษาสมบัติของ MpAmy พบว่าเร่งปฏิกิริยาได้สูงที่พีเอช 5.0 – 6.0 และอุณหภูมิสูง 50.0 – 90.0 °C โดยมีกิจกรรมการทำงานสูงสุดที่พีเอช 5.0 และอุณหภูมิ 60.0 °C และยังมีความเสถียรสูงในช่วงพีเอชและอุณหภูมิที่กว้างคือ พีเอช 5.0 – 7.0 และอุณหภูมิ 30.0 – 90.0 °C การศึกษาจลนศาสตร์ของเอนไซม์พบว่ามีค่าคงที่ไมเคลิส (Km) และความเร็วสูงสุด (Vmax) สำหรับการสลายโมเลกุลแป้ง คือ 2.1 mg/mL และ 0.2 µmol/min/mL ตามลำดับ เอนไซม์มีความจำเพาะในการสลายโมเลกุลแป้งสูงที่สุด รองลงมาคือ อะไมโลเพคติน และไกลโคเจน เอนไซม์เร่งปฏิกิริยาสลายสารตั้งต้น Ethylidene–pNP–G7 เท่ากับ 280.8 nmol/min/mL แสดงว่าเป็นอะไมเลสชนิดแอลฟา จากการศึกษาสมบัติแสดงให้เห็นว่า MpAmy เป็นแอลฟาอะไมเลสทนความร้อน ซึ่งมี ความสำคัญในการนำไปประยุกต์ใช้สำหรับอุตสาหกรรมต่าง ๆ โดยเฉพาะอุตสาหกรรมแป้งต่อไป  Purification of α-amylase from germinating cowitch (Mucuna pruriens (L.) DC.) seeds (MpAmy) was carried out using two steps of 35-65% (w/v) Ammonium sulphate fractionation and β-cyclodextrin Sepharose 6B affinity chromatography. The enzyme was purified 216.4-fold with a final specific activity of 91.0 U/mg. Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) analysis exhibited a molecular weight of MpAmy at 58 kDa which corresponded with amylase activity by Zymographic method. Characterization of MpAmy showed high activity at the pH of 5.0-6.0 and the high temperature of 50.0-90.0 ºC. The optimum pH and temperature for the enzyme were at pH 5.0 and 60.0 ºC, respectively. Furthermore, MpAmy was found stable at a wide range of pH 5.0 to 7.0 pH and the temperature between 30 ºC to 90 ºC. The Michalis constant (Km) and Maximum velocity (Vmax) for hydrolysis of starch were 2.1 mg/mL and 0.2 µmoles/min/mL, respectively. The MpAmy showed the highest specific activity toward starch followed by amylopectin and glycogen as their natural substrates. The enzyme catalyzed Ethylidene-pNP-G7at 280.8 nmol/min/mL, indicating it was an alpha amylase. The results from enzyme characterization indicated that MpAmy is the Thermostable α-amylase. Therefore, MpAmy has the potential for applying in different industries, especially the starch industry.