การผลิตโพลีโคลนอลแอนติบอดีจำเพาะต่อไวเทลโลเจนิน ในพลาสมาของปลากะรังจุดฟ้า (Plectropomus maculatus)
Production of Polyclonal Antibody Specific to Plasma Vitellogenin of Blue-spotted grouper, Plectropomus maculatus.
Keywords:
โพลีโคลนอลแอนติบอดี , ไวเทลโลเจนิน , ปลากะรังจุดฟ้า, blue-spotted grouper, Plectropomus maculatus, Polyclonal antibody, vitellogeninAbstract
ได้ผลิตโพลีโคลนอลแอนติบอดีจำเพาะต่อไวเทลโลเจนิน โดยการปลูกภูมิคุ้มกันในหนูขาวด้วยไวเทลโลเจนินที่แยกได้จากพลาสมาของปลากะรังจุดฟ้า Plectropomus maculatus เพศเมียที่ฉีดกระตุ้นด้วยฮอร์โมน 17 เบต้า-เอสตราไดออล และทำให้บริสุทธิ์โดยใช้คอลัมน์ไฮดรอกซิลอะพาไทต์และคอลัมน์เซฟาคริลเอส-300 และเมื่อตรวจสอบไวเทลโลเจนินบริสุทธิ์ที่ได้ด้วยวิธี SDS-PAGE พบว่ามีน้ำหนักโมเลกุลเป็น 102 และ94 kDa ตามลำดับ จากการตรวจสอบความจำเพาะของโพลีโคลนอลแอนติบอดีที่ผลิตได้ด้วยเทคนิค Double immunodiffusion พบว่าสามารถทำปฏิกิริยากับพลาสมาของปลากะรังจุดฟ้าเพศเมียที่ได้รับการฉีดด้วยฮอร์โมนและไวเทลโลเจนินบริสุทธิ์ แต่ไม่ทำปฏิกิริยากับพลาสมาของปลากะรังจุดฟ้าเพศเมียที่ไม่ได้รับการฉีดฮอร์โมนและพลาสมาของปลากะรังจุดฟ้าเพศผู้ และเมื่อศึกษาโดยใช้เทคนิค Western blot พบว่าโพลีโคนอลแอนติบอดีที่ได้สามารถทำปฏิกิริยากับแถบโปรตีนที่แยกได้จากไวเทลโลเจนินบริสุทธิ์ที่มีน้ำหนักโมเลกุลเป็น 94, 75, 70, 68 และ 50 kDa ตามลำดับ Polyclonal antibody (PAb) specific to vitellogenin (VTG) was obtained from mice immunized with VTG isolated from plasma of blue-spotted grouper, Plectropomus maculatus, which was induced by injection of 17 β-estradiol before purification with hydroxylapatite and sephacryl S-300 column. After performing with SDS-PAGE, VTG was identified at the molecular weight of 102 and 94 kDa respectively. The specificity of PAb to VTG determined by double immunodiffusion showed that PAb reacted with the plasma of 17 β-estradiol-injected female and purified VTG. However, the cross-reaction of PAb to the plasma of intact females and the plasma from males was not observed. When using western blot techniques, the PAb was identified the purify VTG at molecular weight of 94, 75, 70, 68 and 50 kDa, respectively. This PAb could be useful in immunological techniques for determination of vitellogenin content of blue-spotted grouper.References
Fernandes, D., Zanuy, S., Bebianno, M.J. & Porte, C. (2008). Chemical and biochemical tools to assess pollution exposure in cultured fish. Environmental Pollution, 152, 138-146.
Henneis, M., Wiesmann, M., Allner, B. & Sauerwein, H. (2003). Vitellogenin in carp (Cyprinus carpio) and perch (Perca fluviatilis): Purification, characterization and development of an ELISA for detection of estrogenic effects. The Science of the Total Environment, 309, 93-103.
Hiramatsu, N., Hiramatsu, K., Hirano, K. & Hara, A. (2002). Vitellogenin-derived yolk proteins in a hybrid sturgeon, bester (Huso huso x Acipencer ruthenus): Identification, characterization and course of proteolysis during embryogenesis. Comparative Biochemistry and Physiology, 131, 429-441.
Korsgaard, B. & Pedersen, K.L. (1998). Vitellogenin in Zoarces viviparous: Purification quantification by ELISA and induction by estradiol-17B and 4-nonylphenol. Comparative Biochemistry and Physiology, 120, 159-166.
Laemmli, U.K. (1970). Cleavage of the structure proteins during the assembly the head of T4. Nature, 227, 680-685.
Liao, T., Jin, S., Yang, F. X., Hui, Y. & Xu, Y. (2006). An enzyme-linked immunosorbent assay for rare minnow (Gobiocypris rarus) vitellogenin and comparison of vitellogenin response in rare minnow and zebra fish (Danio rerio). Science of theTotal Environment, 364,284-294.
Mañanós, E., Zanúy, S., Le, M. F., Carrillo, M. & Núñez, J. (1994). Sea bass (Dicentrarchus labrax L.) vitellogenin: Induction, purification and partial characterization. Comparative Biochemistry and Physiology, 107, 205-216.
Siversand, M. & Specker, T. L. (1993). Vitellogenin in tilapia (Oreochronis massambicus): Induction of two form by estradiol, quantification in plasma and characterization in oocyte extract. Fish Physiology and Biochemistry, 12, 171-182.
Werawatgoompa, S., Piyatiratitivorakul, S., Nitithamyong, C., Aranyakanonda, P., Moree, N., Vajanamarhutue, C., Ruangvejivorachai, & Menasveta, P. (1997). Plasma vitellogenin and growing oocytes of grouper (Cephalopholia pachycentron). Journal of Marine Biotechnology, 5, 137-141.
